Hexarelin: um guia de investigação sobre o GHRP por trás dos estudos do recetor da grelina e da cardioproteção

⚠️ Apenas para fins de investigação — Este artigo aborda o hexarelin estritamente como um composto de investigação laboratorial. Não constitui uma recomendação de medicamento, um guia de dosagem nem aconselhamento médico. O hexarelin não se destina ao consumo humano. Não se destina a diagnosticar, tratar, curar ou prevenir qualquer doença. Todas as afirmações abaixo referem-se a investigação pré-clínica publicada, a investigações in vitro ou a literatura revista por pares, citada apenas para contexto científico.

Introdução

O hexarelin é um hexapéptido sintético que pertence à classe mais ampla dos péptidos libertadores da hormona do crescimento (GHRPs), que começaram a ser desenvolvidos no final da década de 1970 como sondas de pequenas moléculas dos mecanismos de secreção da hormona do crescimento. Juntamente com o GHRP-6, o GHRP-2 e o ipamorelin, o hexarelin tem sido amplamente utilizado na investigação para dissecar a biologia do recetor secretagogo da hormona do crescimento (GHSR-1a), cujo ligando endógeno é a grelina, e, mais recentemente, para investigar a sinalização não mediada pelo GHSR através do recetor scavenger CD36 [1][2].

Para os investigadores que trabalham em endocrinologia, biologia cardiovascular, neurociência ou farmacologia de péptidos, o hexarelin é um composto-ferramenta bem caracterizado, com um substancial corpo de trabalho publicado ao longo de mais de duas décadas. O seu interesse científico advém de três características principais: (1) o composto é quimicamente estável e ativa potentemente o GHSR-1a; (2) exibe efeitos cardioprotetores em modelos pré-clínicos de isquemia-reperfusão que parecem ser, pelo menos em parte, independentes da libertação da hormona do crescimento; e (3) o péptido possui alvos de ligação para além do GHSR-1a, incluindo uma via cardíaca específica mediada pelo CD36 descrita na literatura de investigação [1][3].

Este artigo revê a estrutura do hexarelin, os seus mecanismos de ação e as três principais áreas de investigação em que foi estudado: a sinalização do recetor da grelina, a cardioproteção e a neuroproteção.

Estrutura molecular e bioquímica

O hexarelin é um hexapéptido sintético com a sequência His-D-2-methyl-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2. O seu desenho estrutural exemplifica a estratégia de química medicinal dos GHRP: a introdução de D-aminoácidos (D-2-methyl-Trp na posição 2 e D-Phe na posição 5) confere resistência à degradação proteolítica por aminopeptidases e endopeptidases, enquanto a amidação C-terminal protege contra as carboxipeptidases C-terminais. Em conjunto, estas modificações conferem ao hexapéptido uma estabilidade metabólica substancialmente maior do que a da grelina endógena.

Principais características bioquímicas:

• O tamanho reduzido (~887 Da) torna este GHRP fácil de sintetizar através da química padrão de péptidos em fase sólida com Fmoc e compatível com vias de administração de investigação oral, nasal, subcutânea ou intravenosa em protocolos pré-clínicos.
• Dois resíduos de triptofano (um L-Trp natural, um D-2-methyl-Trp) contribuem para a absorvância UV a 280 nm, o que é útil para a quantificação por HPLC durante a caracterização em investigação.
• Lisina C-terminal básica com terminação em amida confere à molécula uma carga líquida positiva ao pH fisiológico e favorece a interação com superfícies de recetores com carga negativa.
• Estabilidade química: em comparação com a grelina, o composto é mais estável, não é acilado (ao contrário da grelina, que requer a O-octanoilação da Ser3 para a atividade no GHSR-1a) e mantém uma atividade potente numa gama mais alargada de condições de armazenamento e administração [1][4].

Uma vez que o hexarelin não requer uma modificação acilo para ativar o GHSR-1a, constitui uma ferramenta de investigação útil para sondar a biologia do recetor sem as complicações da maquinaria da grelina O-aciltransferase (GOAT) que processa a grelina endógena.

Mecanismo de ação em modelos de investigação

O hexarelin tem dois mecanismos principais descritos na literatura de investigação publicada:

1. Agonismo do GHSR-1a e libertação da hormona do crescimento. O mecanismo clássico: o hexarelin liga-se ao recetor secretagogo da hormona do crescimento de tipo 1a (GHSR-1a) nos somatotrofos da hipófise anterior e nos neurónios hipotalâmicos, ativando a sinalização mediada por Gq, a mobilização de cálcio dependente de IP3 e, a jusante, a secreção de GH. O GHSR-1a é também o recetor endógeno da grelina, e a capacidade deste GHRP de mimetizar a ação da grelina sobre este recetor tornou-o uma ferramenta de investigação amplamente utilizada [1][4].

Em preparações de investigação de hipófise isolada de rato, o péptido produz uma libertação de GH robusta e dependente da dose, com uma potência comparável ou superior à da grelina endógena. A investigação publicada utilizou este composto para caracterizar a dessensibilização do GHSR-1a, a cinética de sinalização e as distinções farmacológicas entre os GHRP e os secretagogos não peptídicos como o MK-0677 [1][5].

2. Sinalização cardíaca mediada pelo CD36. Uma característica distintiva deste GHRP que o diferencia de alguns outros péptidos libertadores da hormona do crescimento é a sua capacidade de se ligar ao CD36, um recetor scavenger expresso em cardiomiócitos, macrófagos e outros tecidos. A revisão de Mao et al. 2014 no Journal of Geriatric Cardiology resumiu as evidências de que o CD36 serve como recetor cardíaco específico do hexapéptido e medeia os seus efeitos cardioprotetores independentemente do GHSR-1a e independentemente da libertação da hormona do crescimento [1]. Este perfil de ligação a dois recetores constitui a base mecanística da utilidade do composto na investigação em modelos cardiovasculares.

Outras vias de sinalização na literatura de investigação sobre o hexarelin incluem:

• Fosforilação de Akt/glicogénio sintase cinase-3β: num modelo de rato de hipóxia-isquemia neonatal, o tratamento com o péptido aumentou a fosforilação de Akt e de GSK-3β, correlacionando-se com uma redução da atividade da caspase-3 e uma diminuição da lesão cerebral [7]. Esta via é amplamente considerada um eixo canónico de sinalização pró-sobrevivência.
• Modulação da sinalização de IL-1: em investigação de I/R cardíaca em rato, o composto reduziu a expressão de IL-1β e aumentou a expressão de IL-1Ra no miocárdio sujeito a I/R, sendo estes efeitos bloqueados pelo antagonista do GHSR-1a [D-Lys3]-GHRP-6, o que indica um componente de modulação inflamatória dependente do GHSR-1a [9].
• Regulação positiva do PTEN e supressão de Akt/mTOR: num modelo de rato de insuficiência cardíaca induzida por laqueação da artéria coronária, o tratamento crónico com este GHRP aumentou a expressão de PTEN e reduziu a via de sinalização Akt/mTOR, melhorando a função ventricular esquerda e reduzindo o stress oxidativo [10].
• Modulação da autofagia: em investigação sobre a hipertrofia induzida por angiotensina II em cardiomiócitos H9C2, o composto potenciou a autofagia através da supressão da sinalização de mTOR, tendo o efeito protetor sido abolido pelo inibidor da autofagia 3-metiladenina [11].
• Preservação da prostaciclina (PGI2): investigação cardíaca inicial relatou que o hexapéptido evitou a queda na libertação de prostaciclina em corações de rato isolados e perfundidos sujeitos a I/R, conferindo um componente de proteção vascular ao fenótipo cardioprotetor [4].

Principais áreas de investigação

1. Investigação sobre o recetor da grelina (GHSR-1a)

Este péptido libertador da hormona do crescimento tem sido um composto de investigação de referência para a biologia do GHSR-1a desde a clonagem e caracterização do recetor no final da década de 1990. A sua utilidade decorre da sua estabilidade química, elevada afinidade para o recetor e farmacologia bem definida. As aplicações em investigação incluem:

• Caracterização da expressão e distribuição do GHSR-1a ao longo do complexo hipotálamo-hipófise e dos tecidos periféricos. A observação de que o GHSR-1a é expresso no tecido cardiovascular conduziu à exploração das ações cardíacas diretas do péptido [1].
• Dissecação farmacológica da sinalização do recetor utilizando o composto em conjunto com antagonistas como o [D-Lys3]-GHRP-6 para distinguir os efeitos dependentes do GHSR-1a dos independentes do GHSR-1a [9].
• Estudos comparativos de GHRP que examinam as diferenças entre este hexapéptido, o GHRP-6, o GHRP-2, o ipamorelin e o secretagogo não peptídico MK-0677 na sua capacidade de ativar os conjuntos de recetores cardíacos versus hipofisários [4][5][8].
• Investigação sobre a regulação por retroação utilizando o composto para sondar a pulsatilidade da GH, a retroação negativa do IGF-1 e a interação da sinalização do GHSR-1a com os estímulos de GHRH e somatostatina.

A revisão clínica e experimental de 1999 de Svensson e Bengtsson resumiu a investigação humana e pré-clínica inicial sobre este GHRP, incluindo os seus efeitos na secreção de GH, na composição corporal em coortes de investigação e no catabolismo induzido pela dieta em voluntários de investigação saudáveis — fornecendo contexto histórico para o campo [5].

2. Investigação sobre a cardioproteção

A área de investigação sobre a cardioproteção é indiscutivelmente onde este GHRP deu o seu contributo mais distintivo. Múltiplos grupos de investigação independentes relataram que o composto protege os cardiomiócitos e corações inteiros da lesão por isquemia-reperfusão em modelos pré-clínicos.

Um estudo fundamental de 1999 de Locatelli e colaboradores demonstrou que os efeitos cardioprotetores do péptido em ratos hipofisectomizados eram independentes da libertação da hormona do crescimento, estabelecendo o caráter independente da GH do fenótipo cardíaco [3]. Esta foi uma descoberta mecanisticamente importante porque separou as ações cardíacas do hexarelin da sua ação somatotrófica clássica e motivou a procura de recetores cardíacos não-GHSR que acabaram por identificar o CD36 como o alvo relevante [1].

A investigação subsequente sobre a cardioproteção relatou:

• Redução do tamanho do enfarte em corações de rato isolados em trabalho sujeitos a isquemia seguida de reperfusão, produzindo o composto uma proteção mensurável que foi parcialmente bloqueada pelo inibidor da proteína cinase C queleritrina [4].
• Proteção dos cardiomiócitos H9c2 contra a morte celular induzida por doxorrubicina através da ligação específica de GHS peptídicos e da inibição da fragmentação do ADN, fornecendo um modelo em linha celular para a cardioproteção anti-apoptótica do péptido [8].
• Melhoria da função ventricular esquerda em ratos com lesão de I/R induzida por laqueação coronária in vivo, tendo sido relatado que este GHRP melhora a função sistólica, reduz a produção de malondialdeído e aumenta a sobrevivência dos cardiomiócitos [9].
• Benefício funcional a longo prazo de uma dose oral única administrada 30 minutos após o enfarte do miocárdio num modelo de ratinho, com uma fração de ejeção mais elevada, rácios de peso pulmonar mais baixos e alterações no equilíbrio autonómico relatados na fase crónica [6].
• Efeitos anti-hipertróficos através do aumento da autofagia em células H9C2 estimuladas com Ang II [11].
• Atenuação da insuficiência cardíaca através da regulação positiva do PTEN e da supressão da via Akt/mTOR num modelo de rato de insuficiência cardíaca induzida por laqueação da artéria coronária (CAL) [10].

Em conjunto, estes relatos estabelecem o composto como uma das ferramentas de investigação em cardioproteção baseadas em péptidos mais exaustivamente caracterizadas, com estudos mecanísticos que abrangem a sinalização (Akt, PKC, mTOR, PTEN), a inflamação (IL-1), a autofagia e as vias de stress oxidativo.

3. Investigação sobre a neuroproteção

Um corpo de investigação mais reduzido, mas digno de nota, examinou os efeitos do composto no sistema nervoso central. O estudo de Brywe et al. de 2005 examinou o péptido num modelo de rato de hipóxia-isquemia neonatal (laqueação carotídea unilateral mais exposição a 7.7% de oxigénio) [7]. Foi relatado que a administração intracerebroventricular imediatamente após o insulto hipóxico-isquémico reduziu os danos cerebrais em relação ao veículo, com redução da lesão no córtex cerebral, no hipocampo e no tálamo, mas não no estriado [7]. O efeito cerebroprotetor foi acompanhado por uma redução da atividade da caspase-3 e por um aumento da fosforilação de Akt e de GSK-3β, ao passo que a sinalização de ERK não foi afetada.

Este foi o primeiro relato publicado de ação neuroprotetora central para este GHRP e fornece um modelo para os investigadores interessados no pré-condicionamento baseado em péptidos ou em intervenções pós-insulto na investigação cerebral hipóxico-isquémica.

Estabilidade, armazenamento e manuseamento no laboratório

Este GHRP é um péptido sintético estável, comparativamente tolerante no ambiente laboratorial:

• Forma liofilizada: estável a -20°C ou -80°C para armazenamento de investigação a longo prazo. O armazenamento de curta duração a 2-8°C é aceitável para frascos por abrir.
• Reconstituição: a água estéril ou o soro fisiológico a 0.9% são solventes de reconstituição padrão em investigação. A água bacteriostática também é utilizada em alguns protocolos de investigação. O conteúdo em D-aminoácidos do péptido e a amida C-terminal conferem robustez a uma ampla gama de pH, embora se prefira um pH neutro (6-8) para uma validade máxima.
• Estabilidade após reconstituição: o composto reconstituído é estável durante vários dias a 2-8°C e durante períodos prolongados a -20°C quando dividido em alíquotas para evitar ciclos de congelamento-descongelamento.
• Caracterização por HPLC e MS: o controlo de qualidade analítico padrão do péptido de grau de investigação inclui a pureza por HPLC de fase reversa (≥95%) e a confirmação por espetrometria de massa da massa esperada do hexapéptido (~887 Da).
• Vias de administração na investigação publicada: as vias subcutânea, intravenosa, intraperitoneal, intracerebroventricular e oral foram todas utilizadas em protocolos de investigação pré-clínica [3][6][7]. A biodisponibilidade difere substancialmente consoante a via, e os desenhos de investigação devem especificar a via e a fundamentação do intervalo de doses.
• Sensibilidade à luz e ao ar: tal como acontece com a maioria dos péptidos que contêm resíduos aromáticos, os frascos de vidro âmbar e o armazenamento em atmosfera inerte melhoram a estabilidade de investigação a longo prazo.

Considerações e limitações de investigação

Efeitos dependentes da GH vs. independentes da GH. Uma vez que as ações do composto ao nível da hipófise libertam GH, muitos efeitos a jusante (por exemplo, a elevação do IGF-1, os efeitos anabólicos) podem ser mediados indiretamente. A separação dos efeitos periféricos diretos dos efeitos mediados pela GH exige controlos hipofisectomizados ou grupos de comparação com GH exógena emparelhados [3].

Seletividade para o recetor. Este GHRP não é um agonista seletivo do GHSR-1a. A sua ligação adicional ao CD36 e, potencialmente, a outros recetores significa que os resultados experimentais requerem uma interpretação mecanística cautelosa, e os investigadores devem incluir antagonistas do GHSR-1a ([D-Lys3]-GHRP-6) ou controlos knockout para CD36 nos casos em que a especificidade mecanística é importante [1][9].

Diferenças entre espécies na expressão de recetores cardíacos. Os padrões de expressão de GHSR-1a e CD36 diferem entre espécies, e a extrapolação da investigação em roedores para outras espécies ou para tecido humano deve ser abordada com precaução.

Taquifilaxia. A administração repetida de GHRP pode produzir dessensibilização da resposta de GH em modelos de investigação, pelo que as experiências de administração crónica devem incluir a quantificação da resposta ao longo do tempo.

Efeitos no cortisol e na prolactina. Em algumas populações de investigação, foi relatado que os péptidos libertadores da hormona do crescimento, incluindo este composto, elevam modestamente o cortisol e a prolactina juntamente com a GH. Os investigadores que medem parâmetros específicos da GH devem incluir estas hormonas como controlos.

Ressalvas translacionais. A maior parte da investigação sobre a cardioproteção foi realizada em modelos pré-clínicos de roedores, e a extrapolação para a investigação cardiovascular humana exige as ressalvas habituais sobre as diferenças entre espécies na biologia dos recetores, na tolerância à isquemia e nos mecanismos de lesão por reperfusão.

Perguntas frequentes de investigação

Q1: Como se compara o hexarelin com a grelina em aplicações de investigação?
O hexarelin e a grelina são ambos agonistas do GHSR-1a, mas o primeiro é quimicamente mais estável e não requer a octanoilação da Ser3 que é essencial para a atividade da grelina no GHSR-1a. Em aplicações de investigação nas quais a ativação do GHSR-1a tem de ser sondada sem a biologia confundente da enzima grelina-O-aciltransferase (GOAT), este hexapéptido é frequentemente preferido. Na investigação cardíaca especificamente, foi relatado que ambos os compostos protegem contra a lesão de I/R, mas o composto tem um mecanismo mediado pelo CD36 mais exaustivamente caracterizado [1][4].

Q2: O hexarelin é seletivo para o GHSR-1a?
Não. Embora este GHRP seja um agonista potente do GHSR-1a, a investigação publicada estabeleceu que também se liga ao CD36 no tecido cardíaco, e esta interação não-GHSR medeia pelo menos parte do seu fenótipo cardioprotetor [1]. Os investigadores interessados num agonismo puro do GHSR-1a em contextos de investigação cardíaca devem ponderar o uso complementar de agonistas mais seletivos.

Q3: Que vias de administração são utilizadas na investigação pré-clínica sobre o hexarelin?
A investigação publicada em roedores empregou a administração subcutânea em estudos de cardioproteção [3][9], a administração intracerebroventricular única em investigação de neuroproteção neonatal [7] e a administração oral em alguns protocolos [6]. A via e a exposição são determinadas pela questão de investigação; nada aqui representa orientação para uso humano.

Q4: Pode o hexarelin ser utilizado in vitro para estudar a biologia dos cardiomiócitos?
Sim. As linhas celulares H9c2 (cardiomioblasto de rato) e C2C12 (mioblasto de ratinho) foram amplamente utilizadas nesta área de investigação. As concentrações publicadas em cultura de células variam de nanomolar a micromolar baixo, dependendo do parâmetro avaliado. Foram caracterizados locais de ligação específicos para o composto (estudos com traçador radiomarcado) nestas linhas celulares [8][11].

Q5: Qual é o melhor painel de parâmetros para a investigação de cardioproteção com este GHRP?
A investigação publicada combina tipicamente medições funcionais (fração de ejeção do ventrículo esquerdo, encurtamento fracional, pressão de perfusão coronária), marcadores bioquímicos (malondialdeído, creatina cinase, troponina), ensaios de viabilidade celular (coloração com TTC para o tamanho do enfarte, TUNEL para a apoptose) e leituras de vias de sinalização (fosforilação de Akt, GSK-3β, mTOR, PTEN) [4][7][9][10]. A combinação específica depende da questão de investigação e da instrumentação disponível.

Referências

De acordo com a PubMed, os seguintes artigos revistos por pares foram utilizados como fontes primárias para esta perspetiva de investigação. São fornecidas ligações DOI sempre que disponíveis.

1. Mao Y, Tokudome T, Kishimoto I. The cardiovascular action of hexarelin. J Geriatr Cardiol. 2014;11(3):253-8. PMID: 25278975. texto completo no PMC
2. Cao JM, Ong H, Chen C. Effects of ghrelin and synthetic GH secretagogues on the cardiovascular system. Trends Endocrinol Metab. 2006;17(1):13-8. PMID: 16309920. DOI
3. Locatelli V, Rossoni G, Schweiger F, et al. Growth hormone-independent cardioprotective effects of hexarelin in the rat. Endocrinology. 1999;140(9):4024-31. PMID: 10465272. DOI
4. Frascarelli S, Ghelardoni S, Ronca-Testoni S, Zucchi R. Effect of ghrelin and synthetic growth hormone secretagogues in normal and ischemic rat heart. Basic Res Cardiol. 2003;98(6):401-5. PMID: 14556085. DOI
5. Svensson JA, Bengtsson B. Clinical and experimental effects of growth hormone secretagogues on various organ systems. Horm Res. 1999;51 Suppl 3:16-20. PMID: 10592439. DOI
6. Mao Y, Tokudome T, Kishimoto I, et al. One dose of oral hexarelin protects chronic cardiac function after myocardial infarction. Peptides. 2014;56:156-62. PMID: 24747279. DOI
7. Brywe KG, Leverin AL, Gustavsson M, et al. Growth hormone-releasing peptide hexarelin reduces neonatal brain injury and alters Akt/glycogen synthase kinase-3beta phosphorylation. Endocrinology. 2005;146(11):4665-72. PMID: 16081643. DOI
8. Filigheddu N, Fubini A, Baldanzi G, et al. Hexarelin protects H9c2 cardiomyocytes from doxorubicin-induced cell death. Endocrine. 2001;14(1):113-9. PMID: 11322493. DOI
9. Huang J, Li Y, Zhang J, Liu Y, Lu Q. The Growth Hormone Secretagogue Hexarelin Protects Rat Cardiomyocytes From in vivo Ischemia/Reperfusion Injury Through Interleukin-1 Signaling Pathway. Int Heart J. 2017;58(2):257-263. PMID: 28321024. DOI
10. Agbo E, Liu D, Li M, et al. Modulation of PTEN by hexarelin attenuates coronary artery ligation-induced heart failure in rats. Turk J Med Sci. 2019;49(3):945-958. PMID: 31091855. DOI
11. Agbo E, Li MX, Wang YQ, et al. Hexarelin protects cardiac H9C2 cells from angiotensin II-induced hypertrophy via the regulation of autophagy. Pharmazie. 2019;74(8):485-491. PMID: 31526442. DOI

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