TB-500 veikimo mechanizmas: kaip timozinas beta-4 reguliuoja aktiną ir angiogenezę

Tik tyrimų tikslais — šiame straipsnyje timozinas beta-4 (TB-500) aptariamas kaip laboratorinis tyrimų junginys. Turinys skirtas mokslininkams, tyrėjams ir dėstytojams. Nevartoti žmonėms. Nė viena čia pateikta informacija nėra medicininė konsultacija.

Šis įrašas yra papildomas CertaPeptides TB-500 grupės straipsnis. Susijęs pagrindinis (pillar) įrašas — BPC-157 + TB-500 tyrimų apžvalga. Išsamią struktūrinę ir biocheminę TB-500 monografiją rasite mūsų esamoje TB-500 tyrimų monografijoje. Šis įrašas konkrečiai skirtas mechanizmų keliams: G-aktino sekvestracijai, VEGF skatinamai angiogenezei bei širdies ir odos signalinėms kaskadoms.

Įvadas: kodėl mechanizmas svarbus TB-500 tyrimams

Timozinas beta-4 (TB4), parduodamas su tyrimų etikete TB-500, yra vienas pleiotropiškiausių peptidų ląstelių biologijoje. Ląstelių biologijos literatūroje jis tiriamas dėl vaidmens aktino reguliavime, ląstelių migracijoje, angiogeniniame signaliniame kelyje ir širdies ląstelių išgyvenimo keliuose ikiklinikinėse modelių sistemose. Suprasti, kodėl jis tai daro — per kokius molekulinius kelius — nėra akademinė smulkmena. Tai lemia, kaip tyrėjai planuoja eksperimentus, kokios modelių sistemos yra tinkamos ir kaip reikėtų interpretuoti rezultatus.

Šiame įraše aprašomos trys pagrindinės mechanizmų ašys, kurios nuosekliai kartojasi TB4 literatūroje: G-aktino sekvestracija, VEGF tarpininkaujama angiogenezė per HIF-1α stabilizaciją ir nuo integrinus jungiančios kinazės (ILK) priklausomas širdies ląstelių signalinis kelias.

1 kelias: G-aktino sekvestracija — pagrindinis kanoninis mechanizmas

Pagrindinė timozino beta-4 funkcija — būti svarbiausiu viduląsteliniu G-aktiną sekvestruojančiu peptidu stuburinių ląstelėse. Hannappelio 2007 m. beta-timozinų apžvalgoje aprašoma, kaip TB4 palaiko polimerizacijai parengtų aktino monomerų rezervą citoplazmoje ir branduolyje, naudodamas savo konservatyvų WH2 (WASP-homologijos 2) domeną G-aktinui prijungti 1:1 stechiometrija (Hannappel, 2007).

Biologinė šios sekvestracijos funkcijos reikšmė nėra pasyvus kaupimas. Kai ląstelės gauna signalus migruoti, formuoti ataugas ar dalytis, laisvų aktino monomerų poreikis staigiai išauga. TB4 sekvestracijos vaidmuo reiškia, kad jis iš esmės veikia kaip aktino buferis, pagal poreikį atpalaiduodamas monomerus ataugų formavimuisi (lamelipodijų, filopodijų) ir citoskeleto reorganizacijai palaikyti. Ląstelėse, kuriose TB4 raiška didelė, G-aktino rezervas yra didelis, migracijos atsakai greitesni, o migracijos kinetika įbrėžimo (scratch) tyrimuose spartesnė.

Šis mechanizmas tiriamas ląstelių migracijos ir įbrėžimo (scratch) tyrimuose. Malinda ir kolegos (1999) susiejo TB4 su padidėjusia keratinocitų ir fibroblastų migracija ląstelės lygmeniu, kurią lemia aktino ir citoskeleto pertvarkymas (Malinda et al., 1999).

Struktūriniu lygmeniu TB4 WH2 modulis specifiškai kontaktuoja su G-aktinu, apimdamas hidrofobinį plyšį tarp aktino subdomenų 1 ir 3. TB4:G-aktino komplekso disociacijos konstanta yra žemame mikromoliniame diapazone — pakankamai stipri, kad sekvestruotų reikšmingą monomerų telkinį, tačiau pakankamai silpna, kad leistų greitą atpalaidavimą, kai nukleacijos veiksniai (pavyzdžiui, Arp2/3 ar forminai) konkuruoja dėl prieinamų monomerų. Šis kinetinis derinimas yra esminis G-aktino sekvestracijos mechanizmo reguliacinės elegancijos elementas.

2 kelias: VEGF raiškos didinimas per HIF-1alpha stabilizaciją

Antra mechanizmų ašis tiesiogiai susieja TB4 su angiogeneze per hipoksijos sukeliamo veiksnio (HIF) signalinį kelią. Ock ir kolegos parodė, kad TB4 stabilizuoja HIF-1α baltymą nuo deguonies nepriklausomu būdu — tai reikšmingas atradimas angiogeniniam signaliniam keliui normoksinėmis sąlygomis (Ock et al., 2012).

HIF-1α yra pagrindinis ląstelės hipoksinio atsako transkripcijos reguliatorius. Esant mažam deguonies kiekiui, HIF-1α kaupiasi ir aktyvina VEGF (kraujagyslių endotelio augimo veiksnio) transkripciją — pagrindinį naujų kraujagyslių formavimosi veiksnį. Normoksinėmis sąlygomis HIF-1α greitai suardomas per nuo prolilhidroksilazės priklausomą ubikvitinaciją. TB4 gebėjimas stabilizuoti HIF-1α net esant normaliai deguonies įtampai reiškia, kad jis gali aktyvinti VEGF raišką — taigi ir angiogenines programas — be hipoksinių sąlygų. Dėl to TB4 yra tinkamas įrankis angiogenezei tirti normoksinėse in vitro sistemose.

Angiogeniniai TB4 poveikiai buvo empiriškai stebimi dar prieš nustatant šį mechanizminį paaiškinimą. Malinda ir kolegos jau 1997 m. parodė, kad TB4 skatino žmogaus bambagyslės venos endotelio ląstelių (HUVEC) kryptingą migraciją — standartiniame in vitro angiogenezės tyrime, — o tai rodo tiesioginį vaidmenį kraujagyslių formavimosi biologijoje (Malinda et al., 1997). HIF-1α stabilizacijos mechanizmas suteikia pirminį molekulinį paaiškinimą šiems vėlesniems kraujagyslių stebėjimams.

Bendras vaizdas toks, kad TB4 angiogenezės kontekste tiriamas per bent du vienas kitą papildančius mechanizmus: tiesioginę nuo G-aktino priklausomą endotelio ląstelių migraciją ir VEGF transkripcijos didinimą per HIF-1α stabilizaciją. Karkasai su įterptu TB4 buvo naudojami šiems mechanizmams pritaikyti audinių inžinerijos kontekste — Ti ir kolegos naudojo kolageno ir chitozano karkasą su kontroliuojamu TB4 atpalaidavimu, siekdami tirti angiogeninę signalinę ašį in vivo (Ti et al., 2015).

3 kelias: integrinus jungiančios kinazės aktyvinimas ir širdies ląstelių signalinis kelias

Kardiologinėje TB4 literatūroje išskiriama trečia mechanizmų ašis, veikianti nepriklausomai nuo G-aktino sekvestracijos. Reikšmingame 2004 m. straipsnyje, paskelbtame žurnale Nature, Bock-Marquette ir kolegos parodė, kad TB4 aktyvina integrinus jungiančią kinazę (ILK) — svarbią PI3K/Akt ląstelių išgyvenimo kelio kinazę — ir skatina širdies ląstelių migraciją bei išgyvenimą po imituotos išeminės pažaidos tiek kultivuotuose kardiomiocituose, tiek pelių modeliuose (Bock-Marquette et al., 2004).

TB4 sukeltas ILK aktyvinimas lemia Akt (dar vadinamo baltymų kinaze B) ir GSK-3β fosforilinimą, įjungiant kanoninį ląstelių išgyvenimo signalą, kuris mažina apoptozę poišeminiuose kardiomiocituose. Šis kelias mechanizmiškai skiriasi nuo G-aktino sekvestracijos ir nereikalauja TB4 WH2 domeno aktyvumo — tai rodo, kad TB4 turi nepriklausomus funkcinius modulius, iš kurių kiekvienas įjungia skirtingus tolesnius signalus.

Smart ir kolegos praplėtė šį supratimą, parodydami, kad TB4 skatina epikardo pirmtakų ląstelių migraciją ir diferenciaciją į vainikines kraujagysles formuojančias linijas suaugusių pelių širdies eksplantų modeliuose (Smart et al., 2007). Suaugusiojo epikardas paprastai yra ramybės būsenos, tačiau TB4, atrodo, geba iš naujo suaktyvinti embrioninę migracijos programą epikardo ląstelėse — tai atradimas, akivaizdžiai svarbus širdies ląstelių biologijai. Pipes ir Yang vėliau apibendrino platesnę kardioprotekcijos literatūrą, apžvelgdami antifibrozinį, proangiogeninį ir citoprotekcinį TB4 signalinį vaidmenį įvairiuose ikiklinikiniuose širdies modeliuose (Pipes & Yang, 2016).

Kur mechanizmai susikerta

Pirmiau aprašyti keliai — nuo aktino priklausoma ląstelių migracija, HIF-1α/VEGF angiogeninis signalinis kelias ir ILK tarpininkaujamas ląstelių išgyvenimo signalinis kelias — susikerta ląstelių migracijos ir angiogenezės modelių sistemose, todėl TB4 minimas didelėje dalyje ikiklinikinės ląstelių biologijos literatūros.

Ko mechanizmas mums NEATSKLEIDŽIA

Keletas svarbių apribojimų riboja TB4 mechanizmo literatūros interpretaciją. TB4 nesijungia prie apibūdinto membraninio receptoriaus klasikine GPCR ar RTK prasme — jo viduląstelinis aktyvumas yra nepriklausomas nuo receptorių, o ekstraląstelinio TB4 signalinio kelio biologija tebėra ne visiškai išaiškinta. Be to, kai kuriuos TB4 poveikius širdies ir kraujagyslių bei inkstų modeliuose gali lemti Ac-SDKP — tetrapeptidas, susidarantis skaidant TB4, — o ne pats TB4, ir tai apsunkina mechanizmų priskyrimą, kai tuo pat metu yra tiek pirminis peptidas, tiek metabolitas.

Svarbiausia: čia apibendrinti mechanizmų duomenys yra ikiklinikiniai. Jie apibūdina, ką TB4 daro ląstelių kultūrų sistemose ir gyvūnų modeliuose. Jie neįrodo lygiaverčių mechanizmų žmonėms tiriamosiomis ar kitomis sąlygomis. TB-500 nėra skirtas vartoti žmonėms ir tiekiamas tik laboratorinių tyrimų tikslais.

Pagrindinės išvados

• TB-500 (timozinas beta-4) veikia bent trimis mechanizmiškai skirtingais keliais: G-aktino sekvestracija, VEGF raiškos didinimu per HIF-1α stabilizaciją ir nuo ILK/Akt priklausomu širdies ląstelių išgyvenimo signaliniu keliu.
• G-aktino sekvestracija yra pagrindinė kanoninė funkcija; ji paaiškina promigracinius TB4 poveikius keratinocitams, fibroblastams ir endotelio ląstelėms.
• VEGF raiškos didinimas per HIF-1α stabilizaciją suteikia mechanizminę sąsają tarp TB4 ir angiogenezės, nepriklausomą nuo hipoksinių sąlygų.
• ILK aktyvinimas yra atskira, būdinga širdžiai signalinė ašis, kurią nustatė Bock-Marquette et al. (2004) ir kuri nepriklauso nuo aktino sekvestracijos.

Šaltiniai

1. Hannappel E. beta-Thymosins. Ann N Y Acad Sci. 2007;1112:21-37. PMID: 17468232. DOI: 10.1196/annals.1415.018
2. Malinda KM, Sidhu GS, Mani H, et al. Thymosin beta4 accelerates wound healing. J Invest Dermatol. 1999;113(3):364-8. PMID: 10469335. DOI: 10.1046/j.1523-1747.1999.00708.x
3. Malinda KM, Goldstein AL, Kleinman HK. Thymosin beta 4 stimulates directional migration of human umbilical vein endothelial cells. FASEB J. 1997;11(6):474-81. PMID: 9194528. DOI: 10.1096/fasebj.11.6.9194528
4. Ock MS, Song KS, Kleinman H, Cha HJ. Thymosin beta4 stabilizes hypoxia-inducible factor-1alpha protein in an oxygen-independent manner. Ann N Y Acad Sci. 2012;1270:46-53. PMID: 23045974. DOI: 10.1111/j.1749-6632.2012.06657.x
5. Ti D, Hao H, Xia L, et al. Controlled release of thymosin beta 4 using a collagen-chitosan sponge scaffold augments cutaneous wound healing and increases angiogenesis in diabetic rats with hindlimb ischemia. Tissue Eng Part A. 2015;21(3-4):541-9. PMID: 25204972. DOI: 10.1089/ten.TEA.2013.0750
6. Bock-Marquette I, Saxena A, White MD, Dimaio JM, Srivastava D. Thymosin beta4 activates integrin-linked kinase and promotes cardiac cell migration, survival and cardiac repair. Nature. 2004;432(7016):466-72. PMID: 15565145. DOI: 10.1038/nature03000
7. Smart N, Risebro CA, Melville AA, et al. Thymosin beta-4 is essential for coronary vessel development and promotes neovascularization via adult epicardium. Ann N Y Acad Sci. 2007;1112:171-88. PMID: 17495252. DOI: 10.1196/annals.1415.000
8. Pipes GT, Yang J. Cardioprotection by Thymosin Beta 4. Vitam Horm. 2016;102:209-26. PMID: 27450736. DOI: 10.1016/bs.vh.2016.04.004
9. Kleinman HK, Sosne G. Thymosin beta4 Promotes Dermal Healing. Vitam Horm. 2016;102:251-75. PMID: 27450738. DOI: 10.1016/bs.vh.2016.04.005
10. Sosne G, Dunn SP, Kim C. Thymosin beta4 significantly improves signs and symptoms of severe dry eye in a phase 2 randomized trial. Cornea. 2015;34(5):491-6. PMID: 25826322. DOI: 10.1097/ICO.0000000000000379

---

Atsakomybės apribojimas: šis straipsnis skirtas tik švietimo ir tyrimų tikslais. Pateikta informacija nėra medicininė konsultacija. TB-500 (timozinas beta-4) nėra patvirtintas terapiniam vartojimui žmonėms.