7 често срещани грешки при реконституция на пептиди, които изследователите допускат

Всеки изследовател на пептиди е бил в тази ситуация. Отваряте нов флакон, смесвате разтворителя си и час по-късно се взирате в мътен разтвор, чудейки се къде всичко се е объркало. Реконституцията изглежда проста на хартия — добавяте течност към прах и готово. Но детайлите са по-важни, отколкото повечето хора осъзнават, а малки грешки могат да унищожат пептиди за стотици долари за секунди.

Ето седем грешки при реконституция, които виждаме изследователите да допускат отново и отново, и как да избегнете всяка от тях.

1. разклащане на флакона вместо леко завъртане

Това е най-често срещаната грешка и вероятно най-вредната. пептидите са големи, крехки молекули. Енергичното разклащане създава пяна, въвежда въздушни мехурчета и генерира срязващи сили, които могат да денатурират пептидната верига — трайно променяйки структурата й и правейки я безполезна за изследвания.

Решението е просто: леко завъртайте флакона с бавно кръгово движение. Оставете разтворителя да се стича по вътрешните стени на стъклото. Ако лиофилизираният прах не се разтвори веднага, оставете флакона и изчакайте. Повечето пептиди ще се разтворят напълно в рамките на 5 до 10 минути с периодично леко завъртане. Ако все още виждате частици след 15 минути, може да имате проблем с разтворимостта (вижте грешка #2).

2. използване на грешен разтворител

Бактериостатичната вода е стандартният разтворител за реконституция за повечето изследователски пептиди, и има основателна причина за това. 0.9% бензилов алкохол действа като консервант, поддържайки разтвора стерилен при многократни изтегляния в продължение на дни или седмици. Но не всеки пептид се съчетава добре с нея.

Някои пептиди изискват стерилна вода, други се нуждаят от разтвор на оцетна киселина, а няколко изискват DMSO за първоначално солюбилизиране преди разреждане. Използването на обикновена стерилна вода, когато Ви трябва бактериостатична вода, означава липса на консервант — Вашият разтвор става риск за контаминация след първото пробиване с игла. Използването на разтворител с грешно pH може да причини агрегация или преципитация.

Винаги проверявайте указанията на производителя за реконституция, преди да отворите каквото и да било. Сертификатът за анализ трябва да посочва препоръчания разтворител. В Certapeptides нашите COA включват препоръки за реконституция за всеки продукт и предлагаме бактериостатична вода във флакони от 3 ml, 5 ml и 10 ml точно поради тази причина.

3. грешка в изчисленията

Изчисленията на концентрацията затрудняват дори опитни изследователи. Имате флакон от 5 mg. Добавяте 2 ml бактериостатична вода. Каква е концентрацията Ви на 0.1 ml? Ако трябваше да спрете и да помислите за това, не сте сами.

Самата математика е ясна — 5 mg в 2 ml Ви дава 2.5 mg/ml, така че 0.1 ml съдържа 250 mcg — но правенето й под напрежение, когато са заложени скъпи пептиди, води до грешки. Изследователите или добавят твърде много разтворител (създавайки неудобно разреден разтвор, който изисква големи обеми за изтегляне), или твърде малко (което прави точните измервания на малки обеми почти невъзможни).

Създадохме калкулатор за реконституция на пептиди на нашия уебсайт специално за да елиминираме този проблем. Въведете количеството пептид, желаната концентрация и размера на спринцовката и той Ви казва точно колко разтворител да добавите и на какво отговаря всяка отметка на спринцовката Ви. Използвайте го всеки път — дори ако мислите, че можете да направите изчислението наум.

4. пръскане на разтворителя директно върху праха

Ето една по-незабележима грешка. Когато вкарате иглата на спринцовката през гумената запушалка и натиснете буталото, тази струя течност удря лиофилизираната маса с изненадваща сила. Прахът може да се разпръсне по стените на флакона, да залепне за запушалката или да образува бучки, които трудно се разтварят.

Вместо това насочете върха на иглата към вътрешната стена на флакона, а не директно към праха. Оставете разтворителя да се стича по стъклото и да се събира на дъното, където постепенно ще навлажни лиофилизираната маса отдолу. Това води до много по-равномерно разтваряне с по-малко частици.

Добавяйте разтворителя бавно. Натискайте буталото с постоянен, лек натиск в продължение на 15 до 30 секунди. Пептидът няма да избяга никъде.

5. пренебрегване на температурата по време на и след реконституцията

Лиофилизираните пептиди са сравнително стабилни при стайна температура за кратки периоди. След реконституция не са. Часовникът започва да тиктака в момента, в който разтворителят срещне праха.

Две температурни грешки са често срещани:

• Реконституиране на замразен флакон без първо размразяване. Ако Вашият пептид е бил съхраняван при -20°C, оставете го да достигне стайна температура, преди да добавите разтворител. Добавянето на вода със стайна температура към замразена пелета създава неравномерно разтваряне и може да спука стъкления флакон от термичен шок.
• Оставяне на реконституирания разтвор на работния плот. След реконституция пептидните разтвори трябва да се поставят в хладилник (2–8°C) в рамките на 30 минути. Някои чувствителни пептиди се разграждат измеримо в рамките на часове при стайна температура. Ако няма да използвате всичко в рамките на 2–4 седмици, разделете в по-малки флакони и замразете при -20°C, за да избегнете повторни цикли на замразяване-размразяване.

Нашето ръководство за съхранение разглежда подробно температурните изисквания за конкретни семейства пептиди.

6. непроверяване на сертификата за анализ

Сертификатът за анализ не е просто лист хартия, който да приберете. Той Ви казва какво реално има във флакона — измерената чистота (чрез HPLC), потвърденото молекулно тегло (чрез масспектрометрия) и всякакви открити примеси или продукти на разграждане.

Защо това има значение за реконституцията? Защото ако Вашият пептид е пристигнал с 94% чистота, когато сте очаквали 99%, ефективната Ви концентрация след реконституция е по-ниска от изчислената. Последващите Ви изследователски резултати ще бъдат отклонени и може да не знаете защо.

В Certapeptides всеки продукт се доставя с COA, показващ ≥99% чистота, проверена чрез независим HPLC и масспектрометричен анализ. Правим ги достъпни на нашата страница за качество, защото прозрачността трябва да бъде стандарт, а не изключение. Винаги преглеждайте COA преди реконституция и сравнявайте действителното съдържание на пептида с означеното количество.

7. повторна употреба на игли или нарушаване на стерилната техника

Реконституцията е стерилна процедура. Всеки компромис, който правите, увеличава риска от бактериална контаминация — а контаминираните пептидни разтвори не само дават лоши изследователски резултати, те могат да провалят цели експериментални серии.

Най-честите нарушения на стерилната техника:

• Повторна употреба на игли между флакони. Една игла, един флакон. Кръстосаната контаминация между различни пептидни разтвори въвежда променливи, които не можете да контролирате.
• Пропускане на тампона с алкохол. Избърсвайте гумената запушалка с тампон със 70% изопропилов алкохол преди всяко вкарване на игла — дори при съвсем нов флакон. Запушалката е била изложена на въздух по време на доставката.
• Работа в замърсена среда. Не Ви е необходим пълен шкаф за биологична безопасност за базова реконституция на пептиди, но Ви трябва чисто работно място с нисък трафик. Избършете плота си с етанол. Дръжте зоната свободна от храна, напитки и отворени съдове. Измийте ръцете си и помислете за носене на нитрилни ръкавици.
• Докосване на иглата. Ако пръстите Ви влязат в контакт с тялото на иглата в който и да е момент, изхвърлете я и използвайте нова.

Обобщение

Добрата техника на реконституция е умение, което отнема пет минути за научаване и цял живот за поддържане. Седемте грешки по-горе обясняват огромното мнозинство от загубите на пептиди в лабораторни условия. Изпълнете тези стъпки правилно и Вашите реконституирани пептиди ще бъдат последователни, стабилни и надеждни.

Кратък контролен списък преди следващата Ви реконституция:

• Прочетете COA и проверете чистотата и препоръчания разтворител
• Оставете флакона да достигне стайна температура, ако преди това е бил замразен
• Обтрийте запушалката с алкохол
• Изчислете концентрацията си (или използвайте нашия калкулатор)
• Добавяйте разтворителя бавно по стената на флакона
• Завъртайте леко — никога не разклащайте
• Охладете в хладилник в рамките на 30 минути след реконституцията
• Етикетирайте флакона с дата, концентрация и използван разтворител

Всички продукти на Certapeptides са произведени до ≥99% чистота с пълна COA документация, защото правилната реконституция започва с това да знаете точно какво има във флакона. Разгледайте нашия пълен каталог или използвайте нашия калкулатор за реконституция, за да планирате следващия си експеримент.

Тази статия е само за информационни и изследователски цели. Продуктите на Certapeptides се продават изключително за лабораторна и изследователска употреба. Не е за консумация от хора.

Източници

1. Manning MC, et al. (2010). Stability of protein pharmaceuticals: an update. Pharmaceutical Research, 27(4), 544-575. PMID: 20143256.
2. Wang W. (1999). Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals. International Journal of Pharmaceutics, 185(2), 129-188. PMID: 10460913.
3. Chi EY, et al. (2003). Physical stability of proteins in aqueous solution: mechanism and driving forces in nonnative protein aggregation. Pharmaceutical Research, 20(9), 1325-1336. PMID: 14567625.
4. Fosgerau K, Hoffmann T. (2015). Peptide therapeutics: current status and future directions. Drug Discovery Today, 20(1), 122-128. PMID: 25450771.